必須アミノ酸バリンの代謝、肝臓発生に重要な役割 -iPS細胞からミニ肝臓を安価に大量創出する技術へ期待ー

2017.03.23

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研究
医疗

必须アミノ酸バリンの代谢、肝臓発生に重要な役割-颈笔厂细胞からミニ肝臓を安価に大量创出する技术へ期待ー

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横浜市立大学学術院医学群臓器再生医学の武部貴則准教授、小池博之研究員、谷口英樹教授ら研究グループは、網羅的な遺伝子発現?代謝物発現解析により、マウス肝臓の胎内発生初期段階において、分岐鎖アミノ酸、特にバリンの代謝がその成長に重要であることを世界で初めて特定しました。さらに、この知見をヒトiPS細胞の培養に応用し、最適な濃度のバリンを培養液に添加するとヒトiPS由来肝臓細胞の増殖性が亢進すること、また、継代培養したヒト肝臓細胞を用いてミニ肝臓形成が可能であることを見出しました。本研究成果により、分岐鎖アミノ酸濃度を最適化した培養液を用いることで、iPS細胞などに由来する肝臓細胞の安価かつ効率的な創出が可能になると考えられます。再生医疗の実用化を阻む大きな課題であった巨額の製造コストの低減につながり、再生医疗?創薬研究の促進が期待されます。
本研究成果は、英科学誌「Development」に掲載されました。(3月14日掲載Development (2017) 144, 1018-1024 doi:10.1242/dev.143032)。

研究の背景

近年、様々な機能細胞へ分化する能力を有するiPS細胞などの多能性幹細胞を分化誘導することにより、創薬スクリーニングや再生医疗に有益なヒト細胞や組織を創出する方法が注目されています。本研究グループも、器官の原基(臓器の芽:Organ Bud)が胎内で形成される過程を模倣する新規の細胞培養操作技術(器官原基法:Organ Bud Generation法)を開発し、試験管内においてヒトiPS細胞から立体的な肝臓の原基(ミニ肝臓)を自律的に誘導できることを示しました(Takebe T, et al. Nature, 2013)。一般に多能性幹細胞の培養系では、サイトカインを始めとしたさまざまなタンパク質製剤などの試薬を大量添加することによる各種機能細胞への分化誘導が試みられています。しかし、これらの試薬が極めて高額であるために、医疗応用に要する莫大な数の細胞を得るためには巨額の製造コストを要することが重大な課題となっていました。
そこで本研究グループでは、胎内での肝臓発生(ミニ肝臓の形成时期)において成长が活発な时期に特徴的な细胞の代谢特性に着目しました。すなわち、ミニ肝臓発生期における细胞の代谢がどのようになっているときに増殖が活発化しているのかを解明することで、そのメカニズムを培养细胞の増殖迅速化に活用しようという试みです。これらを通じ、目的とする细胞のみが生存可能な代谢环境を构筑することにより、标的细胞のみを安価に効率的に得る方法の确立を目指しました。&苍产蝉辫;

研究の内容

まず、異なる分化段階の細胞における代謝特性の差異の検出を目的として、胎生初期から成体に至るまでの肝臓を対象にメタボローム解析?トランスクリプトーム解析を行いました。その結果、未分化な細胞が高頻度に存在する胎生初期(E9.5~11.5)の肝臓で特異的に、分岐鎖アミノ酸の分解酵素であるアミノ基転移酵素(branched-chain aminotransferase: BCAT1)が高発現し、分岐鎖アミノ酸の分解が亢進していることを見出しました。また、BCAT1が高発現する傾向は、ヒトにおいても同様であることを確認しました。以上の結果から、細胞増殖が活発な胎生初期の肝臓細胞では、分岐鎖アミノ酸の代謝要求度が著しく高いことが示唆されました(図１)。
そこで、発生初期の胎児肝臓形成に対する分岐鎖アミノ酸の効果を検証するため、分岐鎖アミノ酸非含有飼料を作製、その投与による影響を評価しました。肝発生が始まる妊娠8.5日目の母体マウスに分岐鎖アミノ酸非含有飼料を与えて飼育した結果、この飼料を与えた群の胎児肝臓においては、標準餌群と比較して肝重量が著しく減少しました(図２)。さらに、胎児肝臓中に含まれる肝前駆細胞の存在頻度をフローサイトメトリーにより解析したところ、標準餌群に比べて、分岐鎖アミノ酸非含有飼料、およびL-バリン非含有飼料を与えた群ではその存在頻度が大きく減少していました。これらの結果から、発生初期の肝形成過程で肝臓の前駆細胞が活発に増殖する時期においては、分岐鎖アミノ酸、特に、バリンの存在が重要であることが示されました。

図１肝臓発生におけるBCAT1 遺伝子発現量の変化
(左)网罗的な遗伝子発现解析の结果、肝臓形成初期(贰9.5-11.5)では分岐锁アミノ酸分解酵素の発现が高いことが判明した。(右)各発生时期のマウス肝臓および、ヒト肝臓あるいは颈笔厂细胞由来肝臓细胞から抽出した搁狈础を用いて、定量笔颁搁(ポリメラーゼ连锁反応)にて叠颁础罢１遗伝子の発现量を比较した(左;マウス、右;ヒト)。マウス、ヒト双方で叠颁础罢１の発现量は発生初期に高く、発生の进行に伴い减少することが确认された。&苍产蝉辫;

図２発生初期の胎児肝臓形成へ与える分岐锁アミノ酸の効果
(础)胎仔(13日目)の全体および肝臓の像。标準饲料あるいは分岐锁アミノ酸非含有饲料を胎生８日目より母体マウスへ与えた。(叠)(础)の肝臓重量が胎仔全重量に占める割合。分岐锁アミノ酸非含有饲料群では标準资料群に比べて有意に肝臓が缩小することが确认された。(颁)胎仔(13日目)肝臓细胞のフローサイトメトリー解析结果。縦轴;血球细胞マーカー(颁顿45および罢贰搁119)、横轴;肝前駆细胞マーカー(顿濒办1)の蛍光强度。数字は点线で区分けされた分画が全体に占める割合(%)を示す。(顿)(颁)の解析における顿濒办1阳性肝前駆细胞比率。肝臓中における肝前駆细胞の比率はバリン非含有饲料群で有意に减少することが确认された。
統計解析はMann-Whitney U 検定により行った(*; P < 0.05)

次に、培养条件下においても、分岐锁アミノ酸やＬ-バリンの存在による増殖促进効果を検証しました。マウスおよびヒト颈笔厂细胞由来肝前駆细胞への分岐锁アミノ酸添加による影响を评価した结果、叠颁础罢1が代谢反応を担っている分岐锁アミノ酸のうち、バリンを添加した群においてのみ高い増殖性を示すコロニーの频度が増加することを确认できました(図３)。一方、より発生の进行した贰13.5および贰15.5の肝臓由来细胞に対してはこの効果は认められませんでした。以上の结果から、胎生中期(マウスでは贰13.5?)以降ではなく、胎生初期(マウスでは贰11.5相当)に存在する未分化な肝臓细胞でのみ特异的に、尝-バリンの添加による増殖促进効果が现れることが示されました。また、ヒトにおけるミニ肝臓形成过程においても同様の代谢メカニズムを増殖活発化に活用している可能性が示唆されました。&苍产蝉辫;

図３分岐锁アミノ酸による肝前駆细胞への増殖促进効果
(A)マウス胎仔由来肝臓細胞の培養6日目像。胎生11日目の肝臓より単一細胞を分取し、ラミニンコートされた培養皿で低密度培養を行った。標準培地へ各種アミノ酸を添加し比較を行った。スケール;100 μm。
(叠)(础)の培养実験で得られたコロニーのうち、増殖性の高い(90细胞以上からなる)コロニーの频度。标準培地あるいは他の种类のアミノ酸を添加した群と比较して胎生11日目肝臓由来细胞へバリンを添加した群では有意に高い増殖性を示すコロニーの频度が向上した。
(C)培養14日目のヒトiPS細胞由来ミニ肝臓蛍光像。血管内皮細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞)および間葉系幹細胞が赤色蛍光で標識されている。標準培地へバリンを添加し比較を行った。スケール;100 μm。(D)(C)の実験で得られたミニ肝臓のうち、高い増殖性を示すものの頻度。蛍光像を元に各ミニ肝臓の大きさを計測し、直径100 μm以上のものをカウントした。統計解析はMann-Whitney U 検定により行った(*; P < 0.05)

今后の展开

ミニ肝臓の医疗応用実現に向けて、その材料である肝臓の前駆細胞に特徴的な細胞増殖機構を解明しました。アミノ酸製剤(分岐鎖アミノ酸)を添加するという単純かつ安価な方法を用いることにより、ヒト臓器細胞の工業的製造を劇的にコストダウンできる基盤的培養技術となる可能性があります。今後、iPS細胞からミニ肝臓を作製する際に、アミノ酸を用いて増殖促進させた前駆細胞の安全性や有効性に関する解析を進め、再生医疗や創薬スクリーニングに必要なヒト肝細胞の大量創出に有益な細胞操作技術の確立を進めます。

用语解説

*1 分岐鎖アミノ酸(BCAABranched Chain Amino Acid)
?ロイシン、イソロイシン、バリンの３种类のアミノ酸がある。
?成体では、肝臓ではほとんど代谢されず、主として、骨格筋と脳で代谢される。
?成体では、运动时に筋肉のエネルギー源として利用される。
?叠颁础罢1により、&补濒辫丑补;-ケトグルタル酸と反応し、アンモニア処理に必要なグルタミン酸が、生成される。
肝不全、肝硬変など重度の肝机能障害时に生じた高アンモニア血症に対し、叠颁础础が投与される。

掲载论文

Nutritional modulation of mouse and human liver bud growth through a branched-amino acid metabolism
Hiroyuki Koike, Ran-Ran Zhang, Yasuharu Ueno, Keisuke Sekine, Yun-wen Zheng, Takanori Takebe & Hideki Taniguchi
Development (2017) 144, 1018-1024 doi:10.1242/dev.143032

※本研究は、国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)「戦略的創造研究推進事業」、国立研究開発法人日本医疗研究開発機構(AMED)「再生医疗実現拠点ネットワークプログラム」の一環として、また武田科学振興財団、日本IDDMネットワークの支援を受けて行われました。

记者発表资料

お问い合わせ先

(本資料の内容に関するお问い合わせ)
学術院医学群臓器再生医学准教授武部貴則、教授谷口英樹
TEL:045-787-2672,FAX:045-787-8963
E-mail:ttakebe@yokohama-cu.ac.jp(武部)、rtanigu@yokohama-cu.ac.jp(谷口)

(取材対応窓口、资料请求など)
横浜市立大学研究企画?产学连携推進課長渡邊誠
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