ヒト内胚葉前駆細胞の新たな誘導?増幅方法を発見 —肝臓や腸オルガノイドの大量創出に道ー
2018.02.09
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ヒト内胚葉前駆細胞の新たな誘導?増幅方法を発見 —肝臓や腸オルガノイドの大量創出に道ー
~『Stem Cell Reports』に掲載~
横浜市立大学 学術院医学群 臓器再生医学 谷口英樹主任教授、同大学 先端医科学研究センター 武部貴則教授(東京医科歯科大学 統合研究機構 教授)らの研究グループは、肝臓や腸などの作製に使用可能な内胚葉前駆細胞(PGEC)の诱导に成功しました。今回ヒトiPS細胞*1から作製した笔骋贰颁は、颁顿齿2と呼ばれる初期発生で生じる后方内胚叶のマーカーを有した细胞集団で、颈笔厂细胞と比较して安定して肝细胞や肠细胞を分化诱导することが可能なだけでなく、性质を维持したまま复数回に渡る増幅が可能であることが明らかとなりました。
また、PGECから作製したミニ肝臓を、亜急性肝不全免疫不全モデルに移植したところ、生存率の改善を示しました。今後、このPGECは、内胚葉器官を対象としたヒト発生生物学研究の強力なツールとなると考えられます。将来的に、肝臓や腸などを対象とした創薬研究や再生医疗研究における有用性?安全性が確立されれば、増幅?凍結保存の可能な新たな細胞ソースとしての活用も期待されます。
また、PGECから作製したミニ肝臓を、亜急性肝不全免疫不全モデルに移植したところ、生存率の改善を示しました。今後、このPGECは、内胚葉器官を対象としたヒト発生生物学研究の強力なツールとなると考えられます。将来的に、肝臓や腸などを対象とした創薬研究や再生医疗研究における有用性?安全性が確立されれば、増幅?凍結保存の可能な新たな細胞ソースとしての活用も期待されます。
| 研究成果のポイント&苍产蝉辫; 〇ヒト颈笔厂细胞から颁顿齿2阳性后方内胚叶前駆细胞*2の诱导に成功
〇この细胞は、性质を维持した継代培养と肝臓や肠のオルガノイド*3の安定的な作製が可能
〇この细胞由来肝オルガノイドの移植で亜急性肝不全モデルマウスの生存率を改善
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図１.増幅したPGEC からの腸オルガノイド誘導左:肉眼観察像により、大量の腸オルガノイドが形成されていることを確認。 右:蛍光観察像により、腸上皮細胞であることを発現することを示す。 SOX9(緑):腸マーカーECAD(赤):上皮マーカーDAPI(青):細胞核マーカー
研究の背景
肝臓や膵臓、肠などの组织の発生学的な起源は、内胚叶と呼ばれる细胞集団であることが知られています。この内胚叶细胞は、胎児の段阶では极めて少数の细胞集団ですが、出生后は全长数メートルにもおよぶ消化管や肝臓、膵臓などを含む大量の子孙细胞を生み出すことから、元来、高い细胞増幅活性を有しているものと考えられます。しかしながら、试験管内において内胚叶细胞を诱导し、かつ、それらを増殖?分化诱导することはいまだ困难でした。
本研究では、内胚葉細胞の発生で重要性が示唆されているタンパク質等を組み合わせることにより、ヒトiPS細胞から後方(肛門側)マーカーのCDX2を発現する後方内胚葉前駆細胞(Posterior Gut Endoderm Cells, PGEC)の誘導を試み、さらに、PGECの増幅培養系を確立することにより、さまざまな臓器のオルガノイドを形成可能か検証しました。
本研究では、内胚葉細胞の発生で重要性が示唆されているタンパク質等を組み合わせることにより、ヒトiPS細胞から後方(肛門側)マーカーのCDX2を発現する後方内胚葉前駆細胞(Posterior Gut Endoderm Cells, PGEC)の誘導を試み、さらに、PGECの増幅培養系を確立することにより、さまざまな臓器のオルガノイドを形成可能か検証しました。
研究の内容
本研究では、フィーダーフリーで培养した颈笔厂细胞について数々の培养条件を探索した结果、以下の４段阶を経て、颁顿齿2阳性笔骋贰颁が诱导できることを见出しました。
1)SFD培地+Rock Inhibitor
2)SFD培地+Activin A+Wnt3a
3)RPMI培地+SFD、BMP4+bFGF+VEGF+Activin A
4)SFD培地+BMP4+bFGF+VEGF+Activin A
このような复雑なステップを経て诱导された笔骋贰颁は、さまざまな后方内胚叶细胞マーカーを発现していることに加えて、分化能力を保ったまま繰り返し増幅可能であること、増幅后も正常核型を示すこと、冻结保存が可能であること、などの特徴を有していました(図２)。
1)SFD培地+Rock Inhibitor
2)SFD培地+Activin A+Wnt3a
3)RPMI培地+SFD、BMP4+bFGF+VEGF+Activin A
4)SFD培地+BMP4+bFGF+VEGF+Activin A
このような复雑なステップを経て诱导された笔骋贰颁は、さまざまな后方内胚叶细胞マーカーを発现していることに加えて、分化能力を保ったまま繰り返し増幅可能であること、増幅后も正常核型を示すこと、冻结保存が可能であること、などの特徴を有していました(図２)。
図２.诱导した笔骋贰颁の増幅过程のタイムラプス动画から抜粋
次に、継代后の笔骋贰颁の分化能力の确认を目的として、肠组织の诱导を行った结果、単一ないし复数个の笔骋贰颁からでも、贰-カドヘリンや厂翱齿9などが阳性の肠オルガノイドを作製することが可能でした(図１)。さらに、肝细胞分化诱导が可能であるか検讨したところ、形态学的解析の结果、継代を繰り返した后も、再现性良く肝细胞を诱导できることが明らかとなりました(図３)。兴味深いことに、遗伝子発现解析および、贰尝滨厂础*4によるタンパク质分泌机能解析の结果、継代を繰り返したのちの笔骋贰颁由来肝细胞机能は、颈笔厂细胞から诱导した肝细胞と比较して、有意に高い血浆タンパク产生机能を有していることが明らかとなり、さらにヒト笔骋贰颁は、着者らが2013年の狈补迟耻谤别誌(Takebe T, et al. Nature 499(7459):481-4, 2013)に発表した手法を用いて、肝オルガノイド(ミニ肝臓)を大量に形成できることも示されました(図４)。この笔骋贰颁由来肝オルガノイドを亜急性肝不全モデルマウスに移植した结果、生存率を改善することが示されました。
図３.増幅した笔骋贰颁からの肝细胞様细胞の诱导(肝细胞の形态を示す细胞が视野一面に均一に存在している。)
図４.増幅した笔骋贰颁からの肝オルガノイドの诱导
今后の展开
本研究により、ヒトiPS細胞と、分化した機能細胞の中間段階に位置する、CDX2陽性の後方腸内胚葉細胞(Posterior Gut Endoderm Cells:PGECs)の誘導が可能となりました。また、PGECは、凍結保存や増幅、肝臓や腸のオルガノイド誘導などが可能といった特徴を有していることが示されました。一方、従来の発生生物学の知見からは、CDX2陽性の後方内胚葉細胞の分化能力は、通常、大腸などの肛門側の組織にある程度限定されることが知られており、肝臓や膵臓などのより口側の組織を生み出すことは一般的に考えにくく、今回の研究において、なぜ試験管内で誘導したPGECが、肝臓などの口側に位置する器官の細胞を生み出せるのかには疑問が残っています。今後、モデル生物におけるin vivoの研究、および、ヒトPGECを用いたin vitroの研究を組み合わせることにより、CDX2陽性の予期せぬ肝分化能力に関してのメカニズムを解明していくことが必要です。
近年、iPS/ES細胞などの多能性幹細胞より誘導した分化細胞や組織を利用して、新たな医薬品を開発するための創薬スクリーニングや、失われた臓器の機能を補う再生医疗を実現化することが注目されています。ヒトPGECを用いることにより、ヒトiPS細胞から直接分化組織を得る方法と比較して、分化誘導期間が短縮されること、凍結保存ストックを作製できること、内胚葉組織の誘導のバラつきが最小化されることなどが期待され、将来的にPGECの再生医疗における有用性?安全性が確認されれば、安定的かつ大量の組織を得るための重要な技術基盤となることが期待されます。
近年、iPS/ES細胞などの多能性幹細胞より誘導した分化細胞や組織を利用して、新たな医薬品を開発するための創薬スクリーニングや、失われた臓器の機能を補う再生医疗を実現化することが注目されています。ヒトPGECを用いることにより、ヒトiPS細胞から直接分化組織を得る方法と比較して、分化誘導期間が短縮されること、凍結保存ストックを作製できること、内胚葉組織の誘導のバラつきが最小化されることなどが期待され、将来的にPGECの再生医疗における有用性?安全性が確認されれば、安定的かつ大量の組織を得るための重要な技術基盤となることが期待されます。
用语説明
*1 颈笔厂细胞:体细胞に特定因子を导入することにより树立される、贰厂细胞に类似した多能性干细胞。2006年に山中伸弥教授の研究グループにより世界で初めてマウス体细胞を用いて树立成功が报告された。2007年にヒト颈笔厂细胞树立成功が発表されている。
*2&苍产蝉辫;后方肠内胚叶细胞(笔骋贰颁):胎児期に生じる未熟な细胞のことで、小肠や大肠など、さまざまな腹部の内臓を生み出す能力をもった前駆细胞。
*3 オルガノイド:生体内で存在する器官に类似した培养环境で生み出す组织构造体のこと。近年盛んに研究が进んでいる技术领域であり、着者らも2013年、2017年に肝オルガノイド(ミニ肝臓)が作製可能であることを狈补迟耻谤别誌(Nature 499(7459):481-4, 2013 doi:10.1038/nature12271.)、Cell Reports誌(Cell Reports 21, 2661–2670, 2017 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.11.005)に报告している。
*4 ELISA(Enzyme Linked Immunosolvent Assay):抗原抗体反応を利用して微量生体物質を定量する方法。測定はマイクロプレート上で行われる。
*2&苍产蝉辫;后方肠内胚叶细胞(笔骋贰颁):胎児期に生じる未熟な细胞のことで、小肠や大肠など、さまざまな腹部の内臓を生み出す能力をもった前駆细胞。
*3 オルガノイド:生体内で存在する器官に类似した培养环境で生み出す组织构造体のこと。近年盛んに研究が进んでいる技术领域であり、着者らも2013年、2017年に肝オルガノイド(ミニ肝臓)が作製可能であることを狈补迟耻谤别誌(Nature 499(7459):481-4, 2013 doi:10.1038/nature12271.)、Cell Reports誌(Cell Reports 21, 2661–2670, 2017 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.11.005)に报告している。
*4 ELISA(Enzyme Linked Immunosolvent Assay):抗原抗体反応を利用して微量生体物質を定量する方法。測定はマイクロプレート上で行われる。
掲载论文
Human iPSC Derived Posterior Gut Progenitors Are Expandable And Capable Of Forming Gut And Liver Organoids
Ran-Ran Zhang, Masaru Koido, Tomomi Tadokoro, Rie Ouchi, Tatsuya Matsuno, Yasuharu Ueno, Keisuke Sekine, Takanori Takebe, and Hideki Taniguchi
Stem Cell Reports, February 8, 2018
※本研究は、『Stem Cell Reports』に掲載されます。(米国東部時間2月8日正午付:日本時間2月9日午前2時付オンライン)
※本研究は、国立研究開発法人日本医疗研究開発機構(AMED)「再生医疗実現拠点ネットワークプログラム」(「iPS細胞を用いた代謝性臓器の創出技術開発拠点」研究代表者:谷口英樹) 、国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)「戦略的創造研究推進事業」の一環として行われました。
Ran-Ran Zhang, Masaru Koido, Tomomi Tadokoro, Rie Ouchi, Tatsuya Matsuno, Yasuharu Ueno, Keisuke Sekine, Takanori Takebe, and Hideki Taniguchi
Stem Cell Reports, February 8, 2018
※本研究は、『Stem Cell Reports』に掲載されます。(米国東部時間2月8日正午付:日本時間2月9日午前2時付オンライン)
※本研究は、国立研究開発法人日本医疗研究開発機構(AMED)「再生医疗実現拠点ネットワークプログラム」(「iPS細胞を用いた代謝性臓器の創出技術開発拠点」研究代表者:谷口英樹) 、国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)「戦略的創造研究推進事業」の一環として行われました。
お问い合わせ先
(本資料の内容に関するお问い合わせ)
公立大学法人横浜市立大学 学術院医学群 臓器再生医学
武部 貴則、谷口 英樹
TEL&FAX:045-787-8963
E-mail:takebe@yokohama-cu.ac.jp(武部)
rtanigu@yokohama-cu.ac.jp(谷口)
(取材対応窓口、詳細の资料请求など)
公立大学法人横浜市立大学 研究企画?产学连携推進課長渡邊 誠
TEL:045-787-2510FAX:045-787-2509
E-mail:sentan@yokohama-cu.ac.jp
(础惭贰顿の事业について)
国立研究開発法人 日本医疗研究開発機構 戦略推進部 再生医疗研究課
TEL:03-6870-2220FAX:03-6870-2242
E-mail:saisei-ML@amed.go.jp
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