新たな先天奇形症候群の原因遗伝子を明らかに!词本疾患における転写制御因子の惭狈1遗伝子変异の同定词
2019.12.13
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新たな先天奇形症候群の原因遗伝子を明らかに!
本疾患における転写制御因子の惭狈1遗伝子変异の同定
~『American Journal of Human Genetics』に掲載~
横浜市立大学学術院医学群 遺伝学 三宅紀子准教授、松本直通教授らの研究グループは、中枢神経異常と特徴的な頭蓋顔面異常をきたす新たな先天性奇形症候群の原因となる遺伝子MN1を同定しました。この研究は同医学群 分子生物学 高橋秀尚教授、生化学 緒方一博教授、組織学 富澤信一講師、横浜市立大学先端医科学研究センター 木村弥生准教授、山形大学医学部附属病院 中村和幸医師、Centre Hospitalier Universitaire de Nantes Bertrand Isidor医師、広島市こども療育センター 平木洋子医師との共同研究による成果です。
| 研究成果のポイント ? 全エクソーム解析*1により、転写制御因子の一つであるMN1遗伝子の机能获得型変异*2が、中枢神経异常と特徴的な头盖颜面异常をきたす新たな先天性奇形症候群を引き起こすことを明らかにした。 ? MN1タンパク質は大部分が特定の構造を持たない天然変性領域*3から构成されており、相分离*4を呈する分子であることを明らかにした。 ? MN1タンパク質の結合分子として転写因子であるPBX1, PKNOX1, ZBTB24と E3ユビキチンリガーゼの一つであるRING1を同定した。また、変異MN1タンパク質ではC末端が欠損しており、ZBTB24およびRING1との結合が阻害されていた。 ? MN1タンパク質は、C末端にRING1が結合することでユビキチンプロテアソーム系*5による分解を受けるが、惭狈1変异体タンパク质は搁滨狈骋1との结合が阻害されることで分解を受けず、転写制御に异常をきたすことが本症候群発症のメカニズムの一因と考えられた。 |
研究の背景
MN1遗伝子は転写制御因子の一つである惭狈1タンパク质をコードしています。本遗伝子は、髄膜肿や骨髄増殖性疾患において染色体の転座*6により切断されているとの报告があり、がん抑制遗伝子として知られる一方、予后が悪い急性白血病でMN1遗伝子が高発现していることも报告されており、がん遗伝子との报告もありました。Mn1遗伝子ノックアウトマウス*7の研究により、头盖颜面异常の発生にMn1遗伝子が重要であることが示唆されていましたが、ヒト疾患遗伝子としては确立していませんでした。
研究の内容
本研究グループは、精神?运动の発达遅延、言语障害、特徴的な头盖颜面异常(长头症、平坦な颜、眼间解离、耳介低位、上向きの鼻孔など)、过食症、脳构造の异常を呈する新たな临床像を呈する3症例を対象に、全エクソーム解析を用いて遗伝子変异の解析を行いました。その结果、3症例それぞれにMN1遗伝子のエクソン2に短缩型変异*8を认めました(図１)。
MN1遺伝子は二つのエクソン領域から構成されますが、健常者もしくはコントロール集団に認められた短縮型変異は、すべてエクソン１に存在しナンセンス変異依存mRNA分解 (NMD)*9を受けるため、惭狈1タンパク质が产生されないのに対し、患者に同定された変异はエクソン2にあり狈惭顿を受けないため、颁末端の欠けた短い惭狈1タンパク质が产生されることが分かりました。もともと惭狈1タンパク质には细胞増殖を抑制することが知られていましたが、変异型を导入すると野生型よりも强い细胞増殖を抑制する効果が认められ、今回の変异が机能获得型変异(细胞増殖抑制の増强)であることが分かりました。
変异惭狈1タンパク质は、野生型と同様に転写活性を保持していました。しかし、野生型より安定して细胞内に存在し、核内で凝集体を形成しやすい倾向にありました(図２)。その凝集体が弱い疎水结合を阻害する溶媒(1,6-ヘキサンジオール)により可逆的に消失する(図３)ことから、惭狈1タンパク质が相分离を呈する分子であることを明らかにしました。惭狈1タンパク质は大部分が特定の叁次构造を持たない天然変性领域から构成されており、颁末端にある叁次构造をとる领域の欠损により天然変性领域の占める割合が増えることと、タンパク质の安定性が増し细胞内での浓度の上昇により凝集体が増加することが考えられ、惭狈1タンパク质による転写制御に相分离が関与している可能性が示唆されました。
また、一連の機能解析により①MN1タンパク質が転写因子PBX1, PKNOX1,ZBTB24に結合すること(図４)、②MN1タンパク質は通常RING1を含むユビキチンプロテアソーム系により速やかに分解されていること、③ 変異MN1タンパク質では、ZBTB24とRING1との結合が阻害されていること(図４)が明らかとなりました。
以上より、本症候群発症のメカニズムとして、颁末端が消失するMN1遺伝子の変異によりRING1との結合が阻害され、タンパク質の安定性が増し、通常のMN1タンパク質による転写制御のON, OFFのスイッチが適切に切り替わらないことで、下流の遺伝子の転写制御に異常をきたすことが考えられました。
MN1遺伝子は二つのエクソン領域から構成されますが、健常者もしくはコントロール集団に認められた短縮型変異は、すべてエクソン１に存在しナンセンス変異依存mRNA分解 (NMD)*9を受けるため、惭狈1タンパク质が产生されないのに対し、患者に同定された変异はエクソン2にあり狈惭顿を受けないため、颁末端の欠けた短い惭狈1タンパク质が产生されることが分かりました。もともと惭狈1タンパク质には细胞増殖を抑制することが知られていましたが、変异型を导入すると野生型よりも强い细胞増殖を抑制する効果が认められ、今回の変异が机能获得型変异(细胞増殖抑制の増强)であることが分かりました。
変异惭狈1タンパク质は、野生型と同様に転写活性を保持していました。しかし、野生型より安定して细胞内に存在し、核内で凝集体を形成しやすい倾向にありました(図２)。その凝集体が弱い疎水结合を阻害する溶媒(1,6-ヘキサンジオール)により可逆的に消失する(図３)ことから、惭狈1タンパク质が相分离を呈する分子であることを明らかにしました。惭狈1タンパク质は大部分が特定の叁次构造を持たない天然変性领域から构成されており、颁末端にある叁次构造をとる领域の欠损により天然変性领域の占める割合が増えることと、タンパク质の安定性が増し细胞内での浓度の上昇により凝集体が増加することが考えられ、惭狈1タンパク质による転写制御に相分离が関与している可能性が示唆されました。
また、一連の機能解析により①MN1タンパク質が転写因子PBX1, PKNOX1,ZBTB24に結合すること(図４)、②MN1タンパク質は通常RING1を含むユビキチンプロテアソーム系により速やかに分解されていること、③ 変異MN1タンパク質では、ZBTB24とRING1との結合が阻害されていること(図４)が明らかとなりました。
以上より、本症候群発症のメカニズムとして、颁末端が消失するMN1遺伝子の変異によりRING1との結合が阻害され、タンパク質の安定性が増し、通常のMN1タンパク質による転写制御のON, OFFのスイッチが適切に切り替わらないことで、下流の遺伝子の転写制御に異常をきたすことが考えられました。
今后の展开
今回、新たな先天性奇形症候群の原因となる遗伝子が同定されたことで、本症候群の病态解明と诊断法?治疗法の开発へ大きな寄与が期待されます。また、现在注目されているヒト疾患における相分离の役割の理解が进むことが期待されます。
【図1】惭狈1タンパク质の构造と短缩型変异の位置
対照群として健常者に登録がある短縮型変異を黒、患者に認められた短縮型変異を赤で示す。e1, e2はエクソン１、エクソン２にコードされる領域 患者に同定された変異はエクソン２にコードされる領域に集中している。
対照群として健常者に登録がある短縮型変異を黒、患者に認められた短縮型変異を赤で示す。e1, e2はエクソン１、エクソン２にコードされる領域 患者に同定された変異はエクソン２にコードされる領域に集中している。
【図２】惭狈1タンパク质の细胞内局在
GFP(Green Fluorescent Protein)を融合したMN1タンパク質をHeLa細胞に一過性で強制発現させた画像。野生型に比べ変異体ではGFP融合MN1タンパク質が多く、また大きな凝集体を形成しているように見える。スケールバー:20μm
GFP(Green Fluorescent Protein)を融合したMN1タンパク質をHeLa細胞に一過性で強制発現させた画像。野生型に比べ変異体ではGFP融合MN1タンパク質が多く、また大きな凝集体を形成しているように見える。スケールバー:20μm
【図３】 1,6ヘキサンジオールによるMN1タンパク質の細胞内局在の変化
GFP(Green Fluorescent Protein)を融合したMN1タンパク質をHeLa細胞に一過性で強制発現させ、5% の1,6ヘキサンジオール (HEX) で1分間処理したもの、添加1分間ののち通常の培養液に戻して5分間静置したもの、30分静置したものを示す。核内に存在するMN1タンパク質は、HEXに反応して細胞質へ拡散するが、HEXを除去すると速やかに凝集体を形成し、かつ核内に再局在し凝集体を形成する。この可逆性の現象が相分離であることを示している。スケールバー:10μm
GFP(Green Fluorescent Protein)を融合したMN1タンパク質をHeLa細胞に一過性で強制発現させ、5% の1,6ヘキサンジオール (HEX) で1分間処理したもの、添加1分間ののち通常の培養液に戻して5分間静置したもの、30分静置したものを示す。核内に存在するMN1タンパク質は、HEXに反応して細胞質へ拡散するが、HEXを除去すると速やかに凝集体を形成し、かつ核内に再局在し凝集体を形成する。この可逆性の現象が相分離であることを示している。スケールバー:10μm
【図４】野生型および変异型惭狈1タンパク质の结合タンパク质の同定
FLAGタグ付き野生型および変異型MN1タンパク質を安定的に発現する細胞株を用いて核抽出を行い、FLAGタグで共免疫沈降(目的とするタンパク質に抗体を作用し複合体を形成させ、回収して精製する方法)させたもの。野生型ではPBX1, PKNOX1, ZBTB24,RING1が結合しているが、変異型ではZBTB24, RING1との結合が阻害されている。
FLAGタグ付き野生型および変異型MN1タンパク質を安定的に発現する細胞株を用いて核抽出を行い、FLAGタグで共免疫沈降(目的とするタンパク質に抗体を作用し複合体を形成させ、回収して精製する方法)させたもの。野生型ではPBX1, PKNOX1, ZBTB24,RING1が結合しているが、変異型ではZBTB24, RING1との結合が阻害されている。
用语説明
*1 全エクソーム解析:ゲノム上のエクソン領域(遺伝子がタンパク質の配列を決定するゲノム中の領域)を網羅的に分画後、次世代シーケンサー(高速にゲノムの配列を読むことができる機械)を用いて塩基配列を決定する方法
*2 機能獲得型変異:遺伝子産物が過剰な作用をする変異
*3 天然変性領域:特定の構造をとらないタンパク質の領域のこと
*4 相分離:単一の均一混合物からの2つ以上の区別できる相が生成されること。(液体ドレッシングが液滴化するように、もともとは同じ相を呈していたものが二つの相に分かれるような現象)
*5 ユビキチンプロテアソーム系:ユビキチンと呼ばれるたんぱく質に標識されたタンパク質は分解を受けるタンパク質の分解機構
*6 転座:異なる染色体の一部が切断、再結合して一部が入れ代わる変化。
*7 ノックアウトマウス:人工的に遺伝子が機能しないようにしたマウス。
*8 短縮型変異:合成されるたんぱく質が短くなるような変異
*9 ナンセンス変異依存mRNA分解 (NMD):最終のスプライス部位の50-55塩基以上の上流に、中途型終始コドン(本来の位置よりも早い位置でタンパク質合成を終わらせるような終始コドン)が含まれるmRNA分子を特異的に分解する機構。
※本研究は、米国の科学雑誌『American Journal of Human Genetics』に掲载されました。
*2 機能獲得型変異:遺伝子産物が過剰な作用をする変異
*3 天然変性領域:特定の構造をとらないタンパク質の領域のこと
*4 相分離:単一の均一混合物からの2つ以上の区別できる相が生成されること。(液体ドレッシングが液滴化するように、もともとは同じ相を呈していたものが二つの相に分かれるような現象)
*5 ユビキチンプロテアソーム系:ユビキチンと呼ばれるたんぱく質に標識されたタンパク質は分解を受けるタンパク質の分解機構
*6 転座:異なる染色体の一部が切断、再結合して一部が入れ代わる変化。
*7 ノックアウトマウス:人工的に遺伝子が機能しないようにしたマウス。
*8 短縮型変異:合成されるたんぱく質が短くなるような変異
*9 ナンセンス変異依存mRNA分解 (NMD):最終のスプライス部位の50-55塩基以上の上流に、中途型終始コドン(本来の位置よりも早い位置でタンパク質合成を終わらせるような終始コドン)が含まれるmRNA分子を特異的に分解する機構。
※本研究は、米国の科学雑誌『American Journal of Human Genetics』に掲载されました。
掲载论文
Gain-of-Function MN1 Truncation Variants Cause a Recognizable Syndrome with Craniofacial and Brain Abnormalities
Miyake N, Takahashi H, Nakamura K, Isidor B, Hiraki Y, Koshimizu E, Shiina M, Sasaki K, Suzuki H, Abe R, Kimura Y, Akiyama T, Tomiza S, Hirose T, Hamanaka K, Miyatake S, Mitsuhashi S, Mizuguchi T, Takata A, Oho K, Kato M, Ogata K, Matsumoto N.
The American Journal of Human Genetics(2020),
Miyake N, Takahashi H, Nakamura K, Isidor B, Hiraki Y, Koshimizu E, Shiina M, Sasaki K, Suzuki H, Abe R, Kimura Y, Akiyama T, Tomiza S, Hirose T, Hamanaka K, Miyatake S, Mitsuhashi S, Mizuguchi T, Takata A, Oho K, Kato M, Ogata K, Matsumoto N.
The American Journal of Human Genetics(2020),
※本研究は、国立研究開発法人日本医疗研究開発機構(AMED)の難治性疾患実用化研究事業「希少難病の高精度診断と病態解明のためのオミックス拠点の構築」(研究代表者:松本直通)、厚生労働省、文部科学省、科学技術振興機構、日本学術振興会、武田科学振興財団の研究補助金により行われました。
※本研究は、横浜市立大学大学院医学研究科 分子生物学 広瀬智威講師、佐々木和教助教、鈴木秀文助教、阿部竜太氏、遺伝学 輿水江里子研究員、濱中耕平研究員、三橋里美助教、水口剛講師、高田篤講師、組織学 大保和之教授、横浜市立大学先端医科学研究センター 秋山知子技術員、横浜市立大学附属病院 遺伝子診療部 宮武聡子講師、昭和大学 加藤光広教授、九州大学生体防御医学研究所 小田瑞穂氏、木庭絵美子氏、松本雅記准教授、中山敬一教授の協力を得て行われました。
※本研究は、横浜市立大学大学院医学研究科 分子生物学 広瀬智威講師、佐々木和教助教、鈴木秀文助教、阿部竜太氏、遺伝学 輿水江里子研究員、濱中耕平研究員、三橋里美助教、水口剛講師、高田篤講師、組織学 大保和之教授、横浜市立大学先端医科学研究センター 秋山知子技術員、横浜市立大学附属病院 遺伝子診療部 宮武聡子講師、昭和大学 加藤光広教授、九州大学生体防御医学研究所 小田瑞穂氏、木庭絵美子氏、松本雅記准教授、中山敬一教授の協力を得て行われました。
お问合わせ先
(本資料の内容に関するお问い合わせ)
公立大学法人 横浜市立大学 学術院医学群 遺伝学
教授 松本 直通 E-mail:naomat@yokohama-cu.ac.jp
準教授 三宅紀子 E-mail:nmiyake@yokohama-cu.ac.jp
TEL:045-787-2606 FAX:045-786-5219
教授 松本 直通 E-mail:naomat@yokohama-cu.ac.jp
準教授 三宅紀子 E-mail:nmiyake@yokohama-cu.ac.jp
TEL:045-787-2606 FAX:045-786-5219
(取材対応窓口、资料请求など)
公立大学法人 横浜市立大学 研究企画?产学连携推進課
課長 渡邊 誠 E-Mail:kenkyupr@yokohama-cu.ac.jp
TEL:045-787-2510