神経筋疾患の原因となるリピート伸长病の正确?迅速な遗伝子诊断法を开発
2022.10.27
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神経筋疾患の原因となるリピート伸长病の正确?迅速な遗伝子诊断法を开発
横浜市立大学附属病院 遺伝子診療科 宮武聡子准教授、同大学大学院医学研究科 遺伝学輿水江里子特任助教、藤田京志助教、松本直通教授らの研究グループは、ナノポアシーケンサー*1を用いて、リピート伸长病*2の原因となる病的なリピート伸長変異を網羅的に検出する手法を開発しました。この手法は、ターゲットロングリードシーケンス法(Targeted Long-Read Sequencing : T-LRS)*3を利用しており、従来法に比べて、简便で正确なリピート伸长病の诊断が可能になります。
本研究成果は、ネイチャー?パブリッシング?グループが刊行する科学雑誌「npj Genomic Medicine」に掲載されました。(日本時間2022年10月26日18時)
本研究成果は、ネイチャー?パブリッシング?グループが刊行する科学雑誌「npj Genomic Medicine」に掲載されました。(日本時間2022年10月26日18時)
| 研究成果のポイント ?リピート伸长病の原因となる全遗伝子领域を効率的?网罗的にシーケンスする解析法を构筑した。 ?病的リピート伸长がある神経筋疾患12症例に対して本解析を施行し、全例で正确に诊断可能であった。 ?临床的に脊髄小脳変性症と诊断され、遗伝学的に未诊断の10症例に対して本解析及び従来法を别々に施行した。6例で遗伝子诊断に至り、従来法では判定困难だった2症例についても精密な判断が可能であった。 ?网罗性、迅速性、正确性の点で优れた解析法である。 |
研究背景
リピート伸长病は、遗伝子内の縦列反復配列(タンデムリピート*4)の异常伸长変异を原因とする疾患群です。疾患群の多くは、ショートタンデムリピートと呼ばれる、多くは3から6塩基の反復ユニット配列が、正常多型の范囲を超えて伸长することが原因となります。现在60种类程度の疾患関连リピート伸长配列が発见されていますが、その多くは神経筋疾患の原因になることが分かっています。
近年、様々な遗伝性神経筋疾患に対して、根本治疗につながる治疗法が开発されつつあります。このような治疗法を选択?提供するためには、正确な遗伝子诊断が不可欠なため、精度の高い诊断法のニーズが高まっています。しかしリピート伸长配列は、配列の特性上、従来の笔颁搁法*5を主体とするゲノム解析法が困难でした。とりわけ従来法では、候补となる疾患に特化した解析しかできない(１疾患解析)ため、リピート伸长病を疑って遗伝子検査を行う场合、原因となる遗伝子领域ごとに解析法を最适化し、复数の手法を组み合わせて诊断する必要があり、解析に时间を要し非効率でした。また、笔颁搁抵抗性で病的なリピート伸长を正确に特定できない场合もあり、诊断法に限界もありました。
近年开発されたロングリードシーケンス技术は、笔颁搁法では解析が困难なリピート伸长配列を含むゲノム领域を一続きの配列として解読でき、リピートを构成する塩基配列の决定に优れています。従来法では、病的なリピート伸长の部分的な配列しか捉えることができなかった遗伝子领域でも、この技术を用いることで、リピート伸长配列の全长解読が可能となりました。
近年、様々な遗伝性神経筋疾患に対して、根本治疗につながる治疗法が开発されつつあります。このような治疗法を选択?提供するためには、正确な遗伝子诊断が不可欠なため、精度の高い诊断法のニーズが高まっています。しかしリピート伸长配列は、配列の特性上、従来の笔颁搁法*5を主体とするゲノム解析法が困难でした。とりわけ従来法では、候补となる疾患に特化した解析しかできない(１疾患解析)ため、リピート伸长病を疑って遗伝子検査を行う场合、原因となる遗伝子领域ごとに解析法を最适化し、复数の手法を组み合わせて诊断する必要があり、解析に时间を要し非効率でした。また、笔颁搁抵抗性で病的なリピート伸长を正确に特定できない场合もあり、诊断法に限界もありました。
近年开発されたロングリードシーケンス技术は、笔颁搁法では解析が困难なリピート伸长配列を含むゲノム领域を一続きの配列として解読でき、リピートを构成する塩基配列の决定に优れています。従来法では、病的なリピート伸长の部分的な配列しか捉えることができなかった遗伝子领域でも、この技术を用いることで、リピート伸长配列の全长解読が可能となりました。
研究内容
本研究では、骋谤颈诲滨翱狈シーケンサー(オックスフォード?ナノポアテクノロジーズ社)に搭载された、アダプティブサンプリング*6という新しい技术を用いました。この方法は、ターゲットとする遗伝子领域の顿狈础断片を该当するかどうかリアルタイムに判断し、ターゲット领域だけを効率的にシーケンスする技术です。この方法により、患者さんの顿狈础をシーケンサーに投入すると、リピート病の原因となることが知られている59箇所の遗伝子领域だけ选択的にシーケンスが可能になります(図1)。
図１ T-LRS法でシーケンスされたRFC1遗伝子领域
リピート配列はその長さに個人差が大きく、正常リピート長と病的リピート長の線引きが容易でないことと、正常範囲を明らかに超えて伸長していた場合でも、その中に含まれている配列によっては病原性を持たないこともあるため、検出したリピート伸長配列が病的であるかどうかの判断は難しい場合があります。そこで本研究では、得られたロングリードシーケンスデータに含まれている59遗伝子领域のリピート配列のなかで、疾患を引き起こす可能性のある配列をランキングすることで、原因を迅速に発見する解析パイプラインと診断フローチャートを構築しました(図２)。
図２ T-LRS法によるリピート病の解析パイプライン
まず、従来法で病的リピート伸长配列を有することが确定していた神経筋疾患12症例(阳性コントロール)について、ロングリードシーケンスを行い、构筑したパイプラインで解析を行った结果、すべての患者さんの疾患原因リピート伸长が検出できました。次に、临床的に脊髄小脳変性症と诊断され、遗伝学的诊断がついていなかった10症例に対して本罢-尝搁厂解析を行いました。また、比较のため従来法の遗伝子検査も别々の研究者によって同时并行で行い、结果を突き合わせました。その结果、罢-尝搁厂法では7症例で正常の范囲を逸脱するリピート伸长を検出し(CACNA1A遗伝子に2症例、BEAN1遗伝子に2症例、ATXN8OS/ATXN8遗伝子に1症例、RFC1遗伝子に2症例)、そのうち6例では确実に発症をきたすと判断できる病的リピート伸长であり、遗伝学的に确定诊断が可能でした。この中で1症例は、従来法ではリピート配列のわずかな伸长を検出することが难しく、原因不明と判定されていましたが、罢-尝搁厂法により脊髄小脳変性症6型と诊断できました(図３)。
今回開発したT-LRS法は、およそ4日以内で既知の全リピート伸長疾患の遗伝子领域における網羅的解析が可能であり、原因を疑う遗伝子领域を1か所ごとに解析する従来法(１疾患解析)と比較して、迅速性と正確性において優れていると考えられます。 また、本研究で開発した診断フローチャートを用いることで、ロングリードシーケンスで得られたデータから容易に原因を見つけることが可能になります。
今回開発したT-LRS法は、およそ4日以内で既知の全リピート伸長疾患の遗伝子领域における網羅的解析が可能であり、原因を疑う遗伝子领域を1か所ごとに解析する従来法(１疾患解析)と比較して、迅速性と正確性において優れていると考えられます。 また、本研究で開発した診断フローチャートを用いることで、ロングリードシーケンスで得られたデータから容易に原因を見つけることが可能になります。
図３ 従来法で診断困難だった脊髄小脳変性症6型(SCA6)の解析例
今后の展开
本研究により、罢-尝搁厂法はリピート伸长病において、正确かつ効率的な解析方法であることが明らかになりました。病的なリピート伸长の中には、伸长するリピート配列の塩基パターンが、遗伝的不安定性や疾患の予后や経过に影响を及ぼす因子となることが报告されています。本解析から得られるデータは、诊断のみならず、患者の予后予想等についての判断材料としても有用な情报となることが考えられます。今后、罢-尝搁厂法による网罗的迅速诊断システムが、リピート病の遗伝子诊断や医学的管理に大きく寄与することが期待されます。
研究费
本研究は、国立研究開発法人日本医疗研究開発機構(AMED)の難治性疾患実用化研究事業「新技術を用いた難治性疾患の高精度診断法の開発(研究代表者:松本直通)」、厚生労働省、日本学術振興会、武田科学振興財団、横浜市立大学の支援により実施されました。
论文情报
タイトル:Rapid and comprehensive diagnostic method for repeat expansion diseases using nanopore sequencing
著者: Satoko Miyatake, Eriko Koshimizu, Atsushi Fujita, Hiroshi Doi, Masaki Okubo, Taishi Wada, Kohei Hamanaka, Naohisa Ueda, Hitaru Kishida, Gaku Minase, Atsuhiro Matsuno, Minori Kodaira, Katsuhisa Ogata, Rumiko Kato, Atsuhiko Sugiyama, Ayako Sasaki, Takabumi Miyama Mai Satoh, Yuri Uchiyama, Naomi Tsuchida, Haruka Hamanoue, Kazuharu Misawa, Kiyoshi Hayasaka, Yoshiki Sekijima, Hiroaki Adachi, Kunihiro Yoshida, Fumiaki Tanaka, Takeshi Mizuguchi, and Naomichi Matsumoto
掲载雑誌:npj Genomic Medicine
DOI:
著者: Satoko Miyatake, Eriko Koshimizu, Atsushi Fujita, Hiroshi Doi, Masaki Okubo, Taishi Wada, Kohei Hamanaka, Naohisa Ueda, Hitaru Kishida, Gaku Minase, Atsuhiro Matsuno, Minori Kodaira, Katsuhisa Ogata, Rumiko Kato, Atsuhiko Sugiyama, Ayako Sasaki, Takabumi Miyama Mai Satoh, Yuri Uchiyama, Naomi Tsuchida, Haruka Hamanoue, Kazuharu Misawa, Kiyoshi Hayasaka, Yoshiki Sekijima, Hiroaki Adachi, Kunihiro Yoshida, Fumiaki Tanaka, Takeshi Mizuguchi, and Naomichi Matsumoto
掲载雑誌:npj Genomic Medicine
DOI:
用语説明
*１ ナノポアシーケンサー:1分子のゲノムDNA配列の解析が可能なオックスフォード?ナノポア社のロングリードシークエンサー。ナノポアとよばれるタンパク質の穴を、モータータンパク質を付加したDNA分子が通過する時に、ナノポアが埋め込まれた人工膜を流れる電流値の変化によって、DNAの塩基配列をリアルタイムに解析することができる。
*２ リピート伸長病:特定の塩基配列の繰り返し(リピート配列)が正常範囲を超えて異常に伸長することで引き起こされる疾患群。代表的な疾患として、脊髄小脳変性症やハンチントン病などが知られる。
*３ ターゲットロングリードシーケンス技術:目的とするDNA配列を全ゲノムから抽出し、10 kbから1 Mb以上の塩基配列をリードという単位で一続きに決定するシーケンス技術。
*４ 縦列反復配列 (タンデムリピート):同じ塩基配列(CAGなど)が同方向に連なって繰り返すDNAの繰り返し領域。1~6 塩基を1単位とした繰り返し配列(モチーフ)をショートタンデムリピートと呼ぶ。その繰り返し数や配列に多様性がある。リピート伸長病では、多くの場合3から6塩基の反復ユニット配列が異常に伸長している。
*５ PCR法:特定のDNA 断片を増幅することができる手法。二本鎖DNA を高温で2 本に解離、温度を下げてプライマーを結合させ、DNA ポリメラーゼで相補鎖を伸長させる。このサイクルを25から40 回繰り返す反応で、特定のDNA 断片を増幅することができる。ただし、リピート領域においては、非特異的な配列の繰り返しや高いGC含量、二次構造によってPCR増幅が困難な場合がある。また、PCR増幅時に生じるエラーにより正確な配列の評価が困難となる。
*６ アダプティブサンプリング:Read Until プログラムを用いて、ゲノムポジションや参照配列を指定することにより、標的分子をリアルタイムに選択する技術。目的とするゲノムの領域を物理的に抽出する処理を必要としないため、ターゲット領域をシーケンス毎に柔軟に変更することができる。
*２ リピート伸長病:特定の塩基配列の繰り返し(リピート配列)が正常範囲を超えて異常に伸長することで引き起こされる疾患群。代表的な疾患として、脊髄小脳変性症やハンチントン病などが知られる。
*３ ターゲットロングリードシーケンス技術:目的とするDNA配列を全ゲノムから抽出し、10 kbから1 Mb以上の塩基配列をリードという単位で一続きに決定するシーケンス技術。
*４ 縦列反復配列 (タンデムリピート):同じ塩基配列(CAGなど)が同方向に連なって繰り返すDNAの繰り返し領域。1~6 塩基を1単位とした繰り返し配列(モチーフ)をショートタンデムリピートと呼ぶ。その繰り返し数や配列に多様性がある。リピート伸長病では、多くの場合3から6塩基の反復ユニット配列が異常に伸長している。
*５ PCR法:特定のDNA 断片を増幅することができる手法。二本鎖DNA を高温で2 本に解離、温度を下げてプライマーを結合させ、DNA ポリメラーゼで相補鎖を伸長させる。このサイクルを25から40 回繰り返す反応で、特定のDNA 断片を増幅することができる。ただし、リピート領域においては、非特異的な配列の繰り返しや高いGC含量、二次構造によってPCR増幅が困難な場合がある。また、PCR増幅時に生じるエラーにより正確な配列の評価が困難となる。
*６ アダプティブサンプリング:Read Until プログラムを用いて、ゲノムポジションや参照配列を指定することにより、標的分子をリアルタイムに選択する技術。目的とするゲノムの領域を物理的に抽出する処理を必要としないため、ターゲット領域をシーケンス毎に柔軟に変更することができる。
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