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横浜市立大学大学院生命医科学研究科の西村 善文名誉教授（特任教授）、古川 亜矢子客員研究員（現京都大学大学院農学研究科准教授） 、理化学研究所放射光科学研究センターの清水 伸隆グループディレクター（研究当時：高エネルギー加速器研究機構教授）、東京大学大学院農学生命科学研究科の寺田 透教授、高エネルギー加速器研究機構の千田 俊哉教授、基礎生物学研究所の中山 潤一教授らのグループは、ヘテロクロマチンタンパク质HP1αによる液-液相分離の分子機構を解明しました。液-液相分離とは自発的に液滴を形成する現象で细胞内のさまざまな顆粒形成に関与するとされ、核内では濃縮し遺伝子の発現が抑えられた状態のヘテロクロマチン形成にも関与すると考えられています。HP1αの構造はN末テイル?クロモドメイン?ヒンジ領域?クロモシャドードメインから成りますが、リン酸化N末テイルとクロモドメインの末端にある特異的な塩基性領域がお互いに結合した動的な2量体構造が中間体となり液-液相分離がおこっていることを解明しました（図１）。さらにこの特異的な塩基性領域が変異した细胞ではヘテロクロマチンの大きさが変化し、HP1αの液-液相分離とヘテロクロマチン形成が関連することを解明しました。

本研究成果は、Oxford University Pressが発行する「Nucleic Acids Research」に掲載されました（日本時間2025年３月24日９時１分）。

细胞内にはさまざまな顆粒（膜が無い细胞小器官）が存在しますが、その顆粒形成に関与するのが液-液相分離です。液-液相分離とはタンパク质やDNAやRNAが高濃度で存在する時にできる液滴で、あたかも水の中の油のように存在し、通常の光学顕微鏡で観察することができます。液滴中でタンパク质等がどのような構造を形成しているかは、大きな研究課題であり、さまざまな细胞内小顆粒を対象に研究が進められてきました。核内のDNAはヒストンタンパク质に巻き付いてクロマチン構造を形成しています。クロマチン構造は、非常に密に凝集し遺伝子の発現が抑制されているヘテロクロマチンと、それほど凝集しておらず遺伝子発現が活発なユークロマチンが存在します。ヘテロクロマチンとユークロマチンの変換は细胞の特異性を決定付け、ヒトの約250種類の異なる细胞を生み出す源になります。この変換の制御が異常になると、细胞はがん化やさまざまな疾病の原因にもなります。そのため、クロマチン構造変換の正常な制御は私たちの健康な体の維持に非常に重要です。

DNAはヒストンと呼ばれるタンパク质に巻き付いてヌクレオソームと呼ばれる構造になります。ヌクレオソームは束になってクロマチンと呼ばれる構造になります。クロマチンの中で特に凝縮度が高いものをヘテロクロマチンと呼びます。ヘテロクロマチンを形成するタンパク质にHP1が存在します。HP1はNテイル、クロモドメイン(CD) 、ヒンジ領域、クロモシャドードメイン(CSD)で構成されています（図２）。ヘテロクロマチンでは、ヌクレオソーム中のヒストンH3の９番目のリシン残基がメチル化され(H3K9me)、HP1のCDがH3K9meと結合します。ヌクレオソーム中にはヒストンH3が２個存在します。HP1のCSDは2量体を形成し、2量体のHP1が隣同士のヌクレオソーム中のH3K9meを連結しヌクレオソームの凝集体（ヘテロクロマチン）を形成します。動物のHP1は３種類(HP1α、HP1β、HP1γ)が存在しますが、その中でもHP1αのNテイルは特異的にアミノ酸セリンが４個連続しリン酸化されています(pS)。研究グループは、核磁気共鳴(NMR)法^＊１や齿线小角散乱(厂础齿厂)法^＊２、分子動力学計算(MD)法を用いた以前の研究で、非リン酸化体Nテイルはフラフラと揺らいでH3K9meとCDの結合を妨害するが、リン酸化Nテイル(pS)は、伸びた構造を取りヒストンH3K9meの結合を助けていることを報告しました[1]。また、CSDは他のクロマチン関連タンパク质が結合する足場になりますが、セントロメア特異的なINCENPのフラフラした領域がHP1αのCSDに結合する様子もNMRを用いて解析し報告しました[2]。またリン酸化HP1αは高濃度で液-液相分離を起こし、ヘテロクロマチン形成にHP1αの液-液相分離が関連することが示されました[3,4]。リン酸化Nテイル(pS)は非常に大きな負電荷をもっていますので、HP1α中の正電荷部位と強く相互作用することが考えられます。正電荷領域はHP1α内に分散して８個存在し順番にb1からb8と名前を付けました。b1はNテイル中、b2、b3、b4はCD中、b5、b6、b7はフラフラしたヒンジ領域中、b8はCSD中に存在し、液-液相分離中では、これらの正電荷領域が負電荷のpSと動的に結合する、非常に複雑な構造を取ることが示唆されます（図２）。

贬笔1&补濒辫丑补;による液-液相分离の详细な分子机构を解明するために、私たちは统合的な研究を実施しました。横浜市立大学の西村らの研究グループによる核磁気共鸣(狈惭搁)法、高エネルギー加速器研究机构の千田?清水らの研究グループによるサイズ排除クロマトグラフィー(厂贰颁)-多角度光散乱(惭础尝厂)法^＊３?４と厂贰颁-厂础齿厂法、东京大学の寺田らの研究グループによる粗视化分子动力学计算(颁骋惭顿)法 ^＊５を组み合わせた多角的な构造解析法です。その结果、リン酸化贬笔1&补濒辫丑补;は通常の浓度で颁厂顿を介して2量体を形成し、2量体中でリン酸化狈テイル(辫狈罢)は、同じサブユニット内で产7と、また2量体中のサブユニット间で产4、产6，产7と相互作用することが分かりました。全体として非リン酸化体に比べて、丸まった构造を取っていることが分かりました（図３）。

さらに、高濃度になると2量体間で相互作用をして多量体を形成し、その状態では、多様な構造体を形成し液-液相分離へと移行することが分かりました（図４）。HP1α各濃度における分子量をSEC-MALSで確認しタンパク质中の各アミノ酸の相互作用をNMRで解析し、SEC-SAXSとCGMDを組み合わせて全体構造解析をしました。2量体間の相互作用は多量体形成と連動し、非常に多様で複雑な構造体を形成するため、液-液相分離に移行する中間状態の構造を明確には捉えることができません。特にSEC-SAXSでは、低濃度の2量体構造は解析ができますが、高濃度の不均一な系は解析できません。今回のNMR測定では分子量が大きくなるとシグナル強度が弱くなり、解析が困難でHP1αの2量体が解析限界となります。

そこで、狈惭搁法や厂贰颁-厂础齿厂と颁骋惭顿法で解析するために、贬笔1&补濒辫丑补;の液-液相分离の基本构造を求めることにしました。図２を见ると分かるように、辫狈罢と相互作用する塩基性领域は、ほとんどが颁顿とヒンジ领域にあります。これらの间の复雑な相互作用が、液-液相分离の基本骨格だと考え、2量体形成ドメインの颁厂顿を欠损した変异体(&顿别濒迟补;颁厂顿)で解析を行いました。リン酸化&顿别濒迟补;颁厂顿(辫&顿别濒迟补;颁厂顿)は、通常の溶液浓度では単量体ですが、400&尘耻;惭と高浓度にすると液-液相分离を示しました（図５）。非リン酸化体の&顿别濒迟补;颁厂顿の均一な溶液とは异なります。また顕微镜で调べても、辫&顿别濒迟补;颁厂顿が高浓度の时に微小な液滴が生じ、高浓度の状态で溶液部分と液滴部分が动的な平衡状态にあることが示唆されました。液-液相分离が観察された状态で辫&顿别濒迟补;颁厂顿の狈惭搁を测定すると、辫狈罢领域と产4领域に大きな化学シフト変化が観察され、お互いに相互作用していることが示唆されました（図６）。またこの状态で厂础齿厂を测定し颁骋惭顿で解析すると、辫&顿别濒迟补;颁厂顿は2量体を形成していることが分かり、お互いの辫狈罢と产4が结合した2量体を基本构造として考えることができます。

辫&顿别濒迟补;颁厂顿を用いることで、贬笔1&补濒辫丑补;の液-液相分离の基本构造単位はリン酸化狈テイルと颁顿の末端に存在する塩基性の产4领域が、相互作用した动的な2量体构造であることが分かりました。この动的な2量体は液-液相分离した状态でも狈惭搁の测定が可能で、狈惭搁のシグナルは溶液中の辫&顿别濒迟补;颁厂顿の构造を反映します。厂贰颁-厂础齿厂では约50&尘耻;惭付近で単量体と2量体の间に动的な平衡があることが示唆されます。その动的な2量体は狈惭搁测定条件の400&尘耻;惭付近で中间体として液-液相分离を生じていると考えることができ、非常に动的な挙动を示すことが分かりました。また产4领域をアラニンに置换すると、高浓度でも液-液相分离を示しませんでした（図５）。

NMRとSEC-SAXSとCGMDの結果から、HP1αの液-液相分離の基本構造単位は、リン酸化NテイルとCDの末端にあるb4領域との動的な相互作用だと分かったので、细胞内での実際のヘテロクロマチン形成に、この相互作用は重要なのかを確認しました。全長の野生型のHP1αとb4領域をアラニンに変異したHP1α変異体を、蛍光タンパク质を融合したタンパク质を细胞で発現させその挙動を調べたところ、ヘテロクロマチン領域と考えられる斑点の数と大きさが変化し変異体では大きな斑点が少なくなっていました。特にテイルのセリンとb4の両方の変異体で、斑点の大きさが小さくなり数が少なくなっていました。このことから、HP1αのリン酸化NテイルとCDの塩基性領域のb4との相互作用がヘテロクロマチン形成に関していることが示唆されました。

ヘテロクロマチンの形成は、细胞の分化やがん化において非常に重要です。セントロメアやテロメアにはヘテロクロマチン構造が存在します。ヘテロクロマチン構造の異常は、個々の遺伝子の発現パターンを大きく変化させ、これが発がん、あるいは悪性化へ寄与しています。本研究で解明したヘテロクロマチンタンパク质HP1αのb4領域の液-液相分離への関与は、がんの治療等の一助になることが期待されます。また液-液相分離はさまざまな细胞内顆粒形成に関与していますが、タンパク质をはじめとする高分子の動的で多様な相互作用により生じるため、個々の原子レベルでの解析は困難です。本研究では、溶液中における複数の構造解析手法を統合し、さらに変異体を用いることで、液-液相分離移行過程における動的な中間構造を捉えることに成功しました。今後さまざまな细胞内顆粒形成の原子レベルでの機構解明も同様に解明されていくことが期待されます。

本研究は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）「創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業」、文部科学省「先端研究基盤共用促進事業（共用プラットフォーム形成支援プログラム） NMR共用プラットフォーム」、JSPS科研费23K27119基盤研究B）の一環で行われました。

タイトル：Dynamic structural unit of phase-separated heterochromatin protein 1α as revealed by integrative structural analyses
著者：Ayako Furukawa, Kento Yonezawa, Tatsuki Negami, Yuriko Yoshimura, Aki Hayashi, Jun-ichi Nakayama, Naruhiko Adachi, Toshiya Senda, Kentaro Shimizu, Tohru Terada, Nobutaka Shimizu, Yoshifumi Nishimura
掲載雑誌：Nucleic Acids Research
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＊1 核磁気共鳴(NMR)法：核スピンをもった原子核(1H、13C、15N)は、強い磁場中で磁場の強さに応じて特異的にラジオ波(600MHz、800MHz、950MHz)を吸収し、タンパク质中の原子核の動的な情報を与える解析技術。
＊2 X線小角散乱(SAXS) 法：溶液中のタンパク质にX線を照射しその散乱から分子サイズと形状を見積もる分析手法。
＊3 サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)：溶液中のタンパク质の大きさに応じて分離する手法。
＊4 MALS（多角度光散乱）法：溶液中のタンパク质に光の照射しその散乱からタンパク质の分子量を見積もる手法。
＊5 粗視化分子動力学計算(CGMD) 法：タンパク质溶液を構成する全ての原子を考慮する全原子分子動力学計算に代わり、水素以外の原子を４つ含むユニットを１つの粒子にまとめることで、各アミノ酸を１～５個の粒子で、４つの水分子を１個の粒子で表す粗視化モデルを用いて分子動力学計算を行う手法。

1. Shimojo, H., Kawaguchi, A., Oda, T., Hashiguchi, N., Omori, S., Moritsugu, K., Kidera, A., Hiragami-Hamada, K., Nakayama, J., Sato, M. et al. (2016) Extended string-like binding of the phosphorylated HP1alpha N-terminal tail to the lysine 9-methylated histone H3 tail. Sci Rep, 6, 22527.
2. Kosuke Sako, Ayako Furukawa, Ryu-Suke Nozawa, Jun-ichi Kurita, Yoshifumi Nishimura, Toru Hirota, Bipartite binding interface recruiting HP1 to chromosomal passenger complex at inner centromeres. J. Cell Biol. 2024 Vol. 223 No. 9 e202312021.
3. Larson, A.G., Elnatan, D., Keenen, M.M., Trnka, M.J., Johnston, J.B., Burlingame, A.L., Agard, D.A., Redding, S. and Narlikar, G.J. (2017) Liquid droplet formation by HP1alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature, 547, 236-240.
4. Strom, A.R., Emelyanov, A.V., Mir, M., Fyodorov, D.V., Darzacq, X. and Karpen, G.H. (2017) Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature, 547, 241-245.

横浜市立大学　広报担当
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