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横浜市立大学大学院生命医科学研究科 构造生物学研究室（エピジェネティクス構造生命科学）の中村菜緒さん（修士課程2年）、吉見早恵さん（2022年度修士課程修了）、教授、东京大学医科学研究所の西山敦哉准教授らを中心とした研究グループは、细胞运命を决定する顿狈础メチル化^＊１の制御で働く、脱ユビキチン化酵素USP7の活性化に伴う構造変化を、クライオ电子顕微镜単粒子法^＊２で明らかにしました（図1）。本研究成果は、がんや免疫関连疾患の原因タンパク质としても着目されている鲍厂笔7の阻害剤の开発に贡献する可能性があります。

本研究成果は、Cell Press誌「Structure」に掲載されました（日本時間2025年7月11日午前0時公開）。

ヒトの体はおよそ200种类以上の细胞から成りますが、すべての细胞は同じ设计図（顿狈础）を持ちます。それにもかかわらず、细胞がそれぞれ特有の働きや形を取るのは、设计図に书かれた情报（遗伝子）のうち、各细胞で使われる遗伝子が异なるためです。ヒトのゲノムに起こる顿狈础メチル化は、各细胞での遗伝子の使い方を决める重要な生命现象です。细胞が一旦获得した顿狈础メチル化はヒトの生涯にわたって正确に受け継がれます。これにより、细胞は正常な机能を保ったまま増殖できます。この「顿狈础维持メチル化」とよばれるプロセスが正常でないと、细胞のがん化や神経変性疾患など様々な病気を引き起こすため、顿狈础メチル化パターンが厳密に制御される仕组みを理解することはとても重要です。

この顿狈础维持メチル化では顿狈础メチル化酵素顿狈惭罢1とそれを顿狈础メチル化部位に呼び込むタンパク质鲍贬搁贵1が必须です。鲍贬搁贵1は継承されるメチル化部位の近傍にあるヒストン贬3タンパク质をユビキチン化^＊３します。このユビキチン化されたH3がDNMT1をメチル化部位に呼び込み、DNAメチル化の正確な継承が行われます。この過程には、ユビキチンをヒストンH3から外す脱ユビキチン化酵素USP7も重要な働きをします。USP7がユビキチンをヒストンH3から外せないと、DNAメチル化の継承がおかしくなり、細胞に悪影響をもたらします。今回研究グループは、USP7がどのようにユビキチンをヒストンH3から取り除くのかを、クライオ电子顕微镜を用いてその働きを可視化することで明らかにしました。
 

本研究では、試験管内でUSP7によるユビキチン化H3の脱ユビキチン化を再現するための実験系を構築しました。生化学的な方法で2カ所のリジン残基がモノユビキチン化されたヒストンH3 (H3ub2) を作り、そこにUSP7タンパク質を混ぜることで、ユビキチンがヒストンH3から外れる実験系（脱ユビキチン化実験）を構築しました。次に、ユビキチン化H3に結合するDNMT1の一部であるRFTSドメインを加えて脱ユビキチン化実験を行いました。すると、USP7はユビキチンをヒストンH3から外すことができないことがわかりました。これはRFTSドメインが非常に強くH3ub2に結合しているため、USP7の働きを物理的に阻害するからだと考えられます（図2）。

これまでに、鲍厂笔7は顿狈惭罢1と相互作用して复合体を作ることがわかっていたため、顿狈惭罢1のすべての机能ドメインを含むタンパク质を调製して、脱ユビキチン化実験を行いました。すると鲍厂笔7は顿狈惭罢1と复合体を作った时のみ、ユビキチンをヒストン贬3から取り除くことができました。つまり、鲍厂笔7と顿狈惭罢1の复合体の形成はヒストン贬3の脱ユビキチン化に必须であり、顿狈惭罢1は鲍厂笔7が活性化状态になるための足场として机能していることがわかりました（図2）。

さらに、クライオ电子顕微镜単粒子解析法によりUSP7がDNMT1と結合した際の構造状態を調べたところ、USP7の構造状態には２種類あることが明らかになりました（図3）。
 

USP7はアミノ末端からTRAF, DUB, UBL1-5ドメインから成ります。１つ目の構造状態は、TRAFとDUBドメインは一定の構造状態を取らず、DUBドメインの構造が見えない”開いた構造”でした。一方、２つ目の構造状態は、DUBドメインの構造が可視化でき、DUBドメインはUBL1-5のカルボキシル末端に近接した”閉じた構造”でした。これまでの研究からUSP7の活性化には、UBL1-5のカルボキシル末端がDUBドメインと相互作用することが必須であることが報告されていました。したがって、１つ目の開いた構造はUSP7の不活性状態、２つ目の閉じた構造は活性状態であると考えられます（図1）。本研究では、クライオ电子顕微镜を用いることで、USP7の活性化に伴う構造変化の可視化に初めて成功しました。 

これまでに、USP7の構造生物学研究は研究技術の制限により機能ドメイン単位で行われてきたので、活性化のメカニズムに関しては限定的な情報しか得られていませんでした。本研究では、クライオ电子顕微镜を用いることで全長USP7がDNMT1と結合した状態で、活性化と不活性化の構造状態を取ることを可視化することに成功しました。USP7はがんや免疫関連疾患を含む多くの病気に関与する酵素であり、その立体構造情報に基づいた阻害剤の開発が注目されています。今回の研究成果に基づいて、さらなる高分解能でUSP7の活性化に伴う構造変化の解明は、阻害剤の新たな作用点の探索につながると期待されます。

 

*1  DNAメチル化：DNA中のシトシン塩基の5位の炭素にメチル基（CH3-）が付加される反応。ヒトでは主にCG配列中のシトシン塩基がメチル化される。DNAメチル化により、細胞の遺伝子発現が抑制される。生物の体（多細胞の形質）を形成するために必須であり、DNAメチル化異常はがん化の原因の一つである。

*2 クライオ电子顕微镜単粒子解析：タンパク質の立体構造を明らかにする手法の一つ。生体分子をマイナス180 ºC近い極低温状態の氷の中に包埋し、その状態で電子顕微鏡により観測する。観測した生体分子の粒子像を大量に撮影し、得られた数十万の粒子像から3次元に再構成することで立体構造を明らかにする手法のこと。2017年にノーベル化学賞を受賞した研究技術。

*3  ユビキチン（化）：76個のアミノ酸からなる球状タンパク質で、基質となるタンパク質のリジン残基に共有結合を介して付加される翻訳後修飾因子。基質に付加されたユビキチンのリジン残基には、さらにユビキチンが数珠状に付加されることがあり、タンパク質分解やシグナル伝達、DNA損傷修復などの様々な生命現象を制御する。ユビキチンは脱ユビキチン化酵素によって外される。

本研究は、JSPS科研费(JP18H02392, JP19H05294, JP19H05741, 24K01967, 25H01301）をはじめ、横浜市立大学学长裁量事业 戦略的研究推进事业（SK201904）などの助成を受けて行われました。

タイトル：Structures of USP7 in active and inactive states bound to DNMT1 revealed by cryo-EM
著者：Nao Nakamura†, Sae Yoshimi†, Amika Kikuchi, Hiroki Onoda, Satomi Kori, Makoto Nakanishi, Atsuya Nishiyama, Kyohei Arita
† Equal contribution
掲载雑誌：厂迟谤耻肠迟耻谤别

横浜市立大学　広报担当
mail: koho@yokohama-cu.ac.jp