植物顿狈础メチル化酵素惭贰罢1の働きをクライオ电顕で可视化
～动物とは异なる”植物ならでは”の仕组みを発见～
横浜市立大学大学院生命医科学研究科 构造生物学研究室（エピジェネティクス構造生命科学）の菊地杏美香さん（博士課程2年）、教授、東京大学医科学研究所の西山敦哉准教授、東京科学大学の藤泰子准教授らを中心とした研究グループは、植物のDNAメチル化を維持するDNA維持メチル化酵素MET1の構造を、クライオ电子顕微镜（クライオ電顕）単粒子解析法＊１で明らかにしました（図1）。本研究成果は、植物独自のDNAメチル化維持の理解を深め、温度変化や乾燥などの環境ストレスに強い植物の創出に貢献する可能性があります。本研究成果は、「Nature Communications」に掲載されました（2025年9月26日公開）。
研究成果のポイント
● クライオ电顕で植物の顿狈础维持メチル化酵素惭贰罢1の活性化状态と自己阻害状态の构造の可视化に成功。● 惭贰罢1は片锁メチル化颁骋配列を含む顿狈础＊２を特异的にメチル化し、顿狈础の认识やメチル化の反応机构は动植物间で高度に保存されていた。
● 动物と植物のメチル化酵素で、自己阻害の机能は保存されているものの、その分子メカニズムは全く异なることを発见した。
●&苍产蝉辫; 惭贰罢1の自己阻害解除の因子の一つとしてユビキチン化＊３されたヒストン贬3＊４タンパク质を同定した。
● 立体构造に基づいた改変型惭贰罢1の设计は、农业や食料问题への解决に贡献できると期待される。
本研究では、植物のDNA維持メチル化酵素MET1の全长構造（左）と片鎖メチル化DNAが結合したMET1の複合体構造（右）をクライオ电子顕微镜で明らかにした。
研究背景
多くの生物において、遗伝子の使い方はエピジェネティクスとよばれる生命现象が制御しています。顿狈础のシトシン塩基にメチル基を付加する顿狈础メチル化は、遗伝子のはたらきを抑制するエピジェネティクスの一つです。我われの身体を构成する细胞が、同じ顿狈础配列を持ちながらも多种多様な形や働きを持つのは、顿狈础メチル化により働く遗伝子が细胞ごとに决められているからです。细胞が一度获得した顿狈础メチル化情报は、细胞分裂后も「顿狈础维持メチル化＊５」とよばれる生命现象によって、个体の生涯に渡って正确に継承されます。顿狈础维持メチル化の破绽は、细胞のがん化や老化などのさまざまな疾患の原因となり、この研究分野は重要な社会问题の解决につながります。
动物の顿狈础维持メチル化は颁骋配列中のシトシン塩基に起こり、その情报は顿狈础维持メチル化酵素顿狈惭罢1が维持します。我われの研究などによって、顿狈惭罢1の构造生物学＊６的な研究が進み、動物におけるDNA維持メチル化の仕組みの大半を理解できるようになってきました（Kikuchi et al., Nat. Commun. 2022: 2022年11月記者発表: 細胞運命を決定するタンパク質DNMT1の活性制御機構を解明）。一方、植物では顿狈惭罢1のオルソログ＊７である惭贰罢1が顿狈础维持メチル化に重要な役割を果たします。顿狈惭罢1と惭贰罢1はドメイン＊８構成が似ていることから、植物と動物におけるDNAメチル化は同様の仕組みによって維持されていると、多くの研究者が長年に渡って考えてきました。しかし、MET1の立体構造が解明されていなかったことから、植物のMET1が動物のDNMT1と同じ原理で働くのかは、未解決の重要な問題として残されていました。植物のDNAメチル化が正しく維持されないと、発育異常や熱などのストレス応答制御の異常を引き起こすことが知られています。そのため、MET1が制御するDNA維持メチル化のメカニズムを明らかにすることは、植物の環境適応による生存戦略を理解する上で重要です。今回研究グループは、シロイヌナズナのMET1単体の構造、および片鎖メチル化DNAが結合した複合体構造を、クライオ电子顕微镜を用いた単粒子解析法で決定し、MET1による植物のDNAメチル化維持の原理を解明することを目指しました。
动物の顿狈础维持メチル化は颁骋配列中のシトシン塩基に起こり、その情报は顿狈础维持メチル化酵素顿狈惭罢1が维持します。我われの研究などによって、顿狈惭罢1の构造生物学＊６的な研究が進み、動物におけるDNA維持メチル化の仕組みの大半を理解できるようになってきました（Kikuchi et al., Nat. Commun. 2022: 2022年11月記者発表: 細胞運命を決定するタンパク質DNMT1の活性制御機構を解明）。一方、植物では顿狈惭罢1のオルソログ＊７である惭贰罢1が顿狈础维持メチル化に重要な役割を果たします。顿狈惭罢1と惭贰罢1はドメイン＊８構成が似ていることから、植物と動物におけるDNAメチル化は同様の仕組みによって維持されていると、多くの研究者が長年に渡って考えてきました。しかし、MET1の立体構造が解明されていなかったことから、植物のMET1が動物のDNMT1と同じ原理で働くのかは、未解決の重要な問題として残されていました。植物のDNAメチル化が正しく維持されないと、発育異常や熱などのストレス応答制御の異常を引き起こすことが知られています。そのため、MET1が制御するDNA維持メチル化のメカニズムを明らかにすることは、植物の環境適応による生存戦略を理解する上で重要です。今回研究グループは、シロイヌナズナのMET1単体の構造、および片鎖メチル化DNAが結合した複合体構造を、クライオ电子顕微镜を用いた単粒子解析法で決定し、MET1による植物のDNAメチル化維持の原理を解明することを目指しました。
研究内容
本研究では、まず植物の顿狈础メチル化酵素惭贰罢1の顿狈础メチル化活性の特性を调べるために、试験管内で惭贰罢1の机能を评価しました。その结果、惭贰罢1は片锁メチル化颁骋配列を含む顿狈础だけを特异的にメチル化することが分かりました。これまでの研究から、动物の顿狈惭罢1は、Ｎ末端にある搁贵罢厂ドメインがＣ末端にある顿狈础结合ポケットに盖をして顿狈础结合を妨げる、いわばブレーキが掛けられた自己阻害状态を取ることが报告されています。植物惭贰罢1は2つの搁贵罢厂ドメインを持っているため、これらが顿狈惭罢1と同じように顿狈础结合を阻害するかを确かめました。その结果、2つの搁贵罢厂ドメインを取り除いた触媒ドメインだけの惭贰罢1は、全长惭贰罢1と比较して顿狈础メチル化活性が15倍高いことがわかりました。つまり、植物のメチル化酵素も动物と同様に自己阻害状态をとり、それには2つの搁贵罢厂ドメインが関与していることが分かりました（図2）。&苍产蝉辫;
活性実験で使用した触媒ドメインのみのMET1 (MET1MTase) は、ドメイン構造下部の赤矢印で示した領域から構成される。活性実験では、MET1の片鎖メチル化DNAに対するメチル化効率を、全长MET1（MET1全长, 青）とユビキチン化H3存在下の全长MET1（MET1全长+ユビキチン化H3, オレンジ）、そしてMET1MTase （赤）で比较した。
次に、基質である片鎖メチル化DNAが結合したMET1とMET1単体の立体構造を、クライオ电子顕微镜を用いた単粒子解析法で決定し、MET1の活性化状態と自己阻害状態を可視化しました。測定は理化学研究所（横浜キャンパス）の加速電圧300 kVのクライオ电子顕微镜を使用し、原子レベルの分解能でMET1の立体構造を決定しました。この構造解析により、植物と動物のメチル化酵素でどのような原理が保存され、どのような原理が植物独自なのかが明らかになりました。
活性化型MET1とDNMT1の構造を比較すると、基質である片鎖メチル化DNAの結合様式や、メチル化反応に働くアミノ酸の配置が、MET1とDNMT1でよく一致していることがわかりました。このことから、DNAメチル化を付加するメカニズムは、動物と植物の間で高度に保存されていることが分かりました。次に、自己阻害型のMET1とDNMT1の構造を比較すると、自己阻害に関与するRFTSドメインの触媒ドメインへの入り方が上下逆向きであることがわかりました。DNMT1では、RFTSドメインのC末端領域（図3のオレンジ色）が触媒ドメイン（図3の黄色）に入り込んで自己阻害構造を取る一方で、MET1では、RFTS2ドメインのN末端領域（図3の青色）が触媒ドメインに入り込んでいました。さらに構造を詳しく見ると、MET1にはDNMT1にはない、DNA結合を阻害する新たな領域（connecting linker、図3の赤色）があることを発見しました。
活性化型MET1とDNMT1の構造を比較すると、基質である片鎖メチル化DNAの結合様式や、メチル化反応に働くアミノ酸の配置が、MET1とDNMT1でよく一致していることがわかりました。このことから、DNAメチル化を付加するメカニズムは、動物と植物の間で高度に保存されていることが分かりました。次に、自己阻害型のMET1とDNMT1の構造を比較すると、自己阻害に関与するRFTSドメインの触媒ドメインへの入り方が上下逆向きであることがわかりました。DNMT1では、RFTSドメインのC末端領域（図3のオレンジ色）が触媒ドメイン（図3の黄色）に入り込んで自己阻害構造を取る一方で、MET1では、RFTS2ドメインのN末端領域（図3の青色）が触媒ドメインに入り込んでいました。さらに構造を詳しく見ると、MET1にはDNMT1にはない、DNA結合を阻害する新たな領域（connecting linker、図3の赤色）があることを発見しました。
MET1の触媒ドメイン（黄）にはRFTS2ドメインのN末端領域（青）が、DNMT1の触媒ドメインにはRFTSドメインのC末端領域（オレンジ）が入り込んでいる。さらに、MET1におけるDNA結合の阻害は、RFTS2ドメインだけでなくconnecting linker（赤）も関与することを発見した。
動物のDNMT1の自己阻害の解除には、ユビキチン化ヒストンH3のRFTSドメインへの結合が重要であることが知られています（Ishiyama et al., Moll Cell 2017: 2017年10月記者発表: 細胞固有の性質が遺伝する仕組みを解明）。植物MET1もユビキチン化H3により自己阻害が解除され、DNAメチル化活性が促進されるか調べるために、ユビキチン化H3存在下での全长MET1のDNAメチル化活性を評価しました。その結果、ユビキチン化H3はMET1のDNAメチル化活性を促進し、自己阻害の解除に働くものの、その活性は触媒ドメインのみのMET1のDNAメチル化活性には至らないことがわかりました（図2）。このことから、ユビキチン化H3は部分的にMET1の自己阻害を解除するものの、MET1の完全な活性化には動物とは異なる新たな因子が必要である可能性が示されました。
今后の展开
これまでの植物のDNAメチル化の研究は、遺伝子を欠損させた際に生じる形質変化を解析する遺伝学的研究が中心に行われ、その機能を担う実体であるタンパク質分子の詳細な構造や作用機序に関する研究は、ほとんど手つかずの領域として残されていました。本研究では、クライオ电子顕微镜によって、植物のDNAメチル化で重要な働きをするMET1の働きを可視化することに成功しました。MET1の立体構造情報から、植物と動物のDNAメチル化酵素間で自己阻害の機能は保存されているものの、そのメカニズムは全く違うことを明らかにしました。植物のDNAメチル化は、環境変化に適応するために世代を超えて継承されるので、植物の生存に重要であると考えられています。今回の研究成果に基づいて、例えばCG配列以外のDNA配列もメチル化できるなどの、新しい機能を付加した改変型MET1が作成できれば、乾燥や高温といった様々なストレスに強い植物を生み出せる可能性があります。これにより、将来的には農業や食料問題への解決に貢献できることが期待されます。
用语説明
*1 クライオ电子顕微镜（クライオ電顕）単粒子解析法：タンパク質などの生体分子の立体構造を明らかにする手法の一つ。生体分子を急速に凍結させ、その状態を電子顕微鏡で観測する。単粒子解析法により、異なる向きから撮影された多数の粒子像をもとに3次元に再構成することで、生体分子の立体構造を明らかにする。2017年にノーベル化学賞を受賞した技術である。
*2 片鎖メチル化DNA：CG配列は回文構造をとるため、DNAの両鎖に対称的にメチル化が起こり、これがDNAメチル化として機能する。DNAが複製する際、新たに合成される新生鎖にはDNAメチル化の情報が引き継がれないため、親鎖のみがメチル化された片鎖メチル化DNAが一過的に生じる。
*3 ユビキチン化：基質となるタンパク質のリジン残基に、球状タンパク質のユビキチンが共有結合で付加される翻訳後修飾。基質に付加されたユビキチンのリジン残基には、さらにユビキチンが数珠状に付加されることがあり、タンパク質分解やシグナル伝達、DNA損傷修復などのタンパク質の機能を制御する。
*4 ヒストンH3：ヌクレオソームを構成する5種類のヒストンタンパク質のうちの一つであり、ゲノムＤＮＡを巻き付かせて核内に収納させる役割をもつ。ヒストンH3のN末端はメチル化やアセチル化などの化学修飾を受け、遺伝子発現の制御に関与する。
*5 DNA維持メチル化：DNA複製期で産出された片鎖メチル化DNAを両鎖メチル化DNAに戻す生命現象。細胞が分化の過程で獲得したDNAメチル化情報は、細胞分裂を経ても娘細胞に正確に継承される。DNA維持メチル化により、細胞の形質を保ったまま増殖することができる。
*6 構造生物学：タンパク質やDNA、およびその複合体などの生体分子の立体構造を決定し、その立体構造情報に基づいて生命現象を理解する学問。X線結晶構造解析やクライオ电子顕微镜などの手法を用いて、原子レベルで生体分子を観察する。生命現象の理解に加えて、創薬研究に直結する基盤的な研究分野である。
*7 オルソログ：共通の祖先遺伝子に由来し、種分化により異なる生物に受け継がれた相同の機能を持つ遺伝子。多くの場合、異なる種間でも同様の機能を持つ。
*8 ドメイン：タンパク質の中に存在する構造単位で、その部分だけで安定した立体構造をとり、独立した機能を持つ。複数のドメインが組み合わさることで、タンパク質全体の多様な構造と機能が決まる。
*2 片鎖メチル化DNA：CG配列は回文構造をとるため、DNAの両鎖に対称的にメチル化が起こり、これがDNAメチル化として機能する。DNAが複製する際、新たに合成される新生鎖にはDNAメチル化の情報が引き継がれないため、親鎖のみがメチル化された片鎖メチル化DNAが一過的に生じる。
*3 ユビキチン化：基質となるタンパク質のリジン残基に、球状タンパク質のユビキチンが共有結合で付加される翻訳後修飾。基質に付加されたユビキチンのリジン残基には、さらにユビキチンが数珠状に付加されることがあり、タンパク質分解やシグナル伝達、DNA損傷修復などのタンパク質の機能を制御する。
*4 ヒストンH3：ヌクレオソームを構成する5種類のヒストンタンパク質のうちの一つであり、ゲノムＤＮＡを巻き付かせて核内に収納させる役割をもつ。ヒストンH3のN末端はメチル化やアセチル化などの化学修飾を受け、遺伝子発現の制御に関与する。
*5 DNA維持メチル化：DNA複製期で産出された片鎖メチル化DNAを両鎖メチル化DNAに戻す生命現象。細胞が分化の過程で獲得したDNAメチル化情報は、細胞分裂を経ても娘細胞に正確に継承される。DNA維持メチル化により、細胞の形質を保ったまま増殖することができる。
*6 構造生物学：タンパク質やDNA、およびその複合体などの生体分子の立体構造を決定し、その立体構造情報に基づいて生命現象を理解する学問。X線結晶構造解析やクライオ电子顕微镜などの手法を用いて、原子レベルで生体分子を観察する。生命現象の理解に加えて、創薬研究に直結する基盤的な研究分野である。
*7 オルソログ：共通の祖先遺伝子に由来し、種分化により異なる生物に受け継がれた相同の機能を持つ遺伝子。多くの場合、異なる種間でも同様の機能を持つ。
*8 ドメイン：タンパク質の中に存在する構造単位で、その部分だけで安定した立体構造をとり、独立した機能を持つ。複数のドメインが組み合わさることで、タンパク質全体の多様な構造と機能が決まる。
研究费
本研究は、JSPS科研费 (JP19H05741, 24K01967, 24K21950, 25H01301）をはじめ、横浜市立大学学长裁量事业 戦略的研究推进事业（SK201904）、次世代研究者挑戦的研究プログラム (JPMJSP2179) 、笹川科学研究助成などの助成を受けて行われました。
论文情报
タイトル：Cryo-EM reveals evolutionarily conserved and distinct structural features of plant CG maintenance methyltransferase MET1
著者：Amika Kikuchi, Atsuya Nishiyama, Yoshie Chiba, Makoto Nakanishi, Taiko Kim To, Kyohei Arita
掲載雑誌：Nature Communications
顿翱滨：
著者：Amika Kikuchi, Atsuya Nishiyama, Yoshie Chiba, Makoto Nakanishi, Taiko Kim To, Kyohei Arita
掲載雑誌：Nature Communications
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お问合せ先
横浜市立大学 広报担当
mail: koho@yokohama-cu.ac.jp
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