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横浜市立大学大学院生命ナノシステム科学研究科 鈴木 凌助教、橘 勝教授、小島 謙一名誉教授ら研究グループは、微小な“ねじれ”を由来とするタンパク质结晶^＊1の不完全性の観测に成功しました。

本研究成果は、米国化学会の国際学術誌「The Journal of Physical Chemistry Letters」に掲載されました。（2024年4月5日）

结晶とは、ダイヤモンドやSi（半導体シリコン）の结晶に代表されるように、原子や分子が規則正しく配列した固体状態のことを示します。その形は、雪の结晶であれば六角形、塩の结晶であれば立方体など、物質固有の结晶学的に安定でフラットな结晶面から構成されています。しかし、一見すると不安定であるにもかかわらず、世の中に存在する多くの结晶はねじれた形を持つことが知られています。最近では、本研究グループによりタンパク质の结晶がわずかにねじれていることを発見し、この“ねじれ”は非対称な形状を持つ分子からなるすべての结晶に存在する、结晶本来の性質である可能性を提案しました[1]。一方、これまで欠陥や“ねじれ”が一切存在しない完全结晶となり得るタンパク质の结晶があることも発見されていました[2]。しかし、なぜねじれ结晶になるのか、なぜ完全结晶になりうるのか、その原理はこれまで未解明でした。

本研究グループは、大型放射光^＊2施设の高エネルギー加速器研究机构「フォトンファクトリー（笔贵）^＊3」のBL-14BおよびBL-20Bにおいて、グルコースイソメラーゼ结晶（以下、GI结晶）のデジタルX線トポグラフィ^＊4を行いました。デジタルX線トポグラフィでは、结晶を微小回転させながら回折X線の強度のふるまいを測定するロッキングカーブ測定^＊5を行いました。今回用いたGI结晶は2種類の结晶構造があります。具体的には、GI分子の積層がわずかに異なるI222（以下、I-GI结晶）とP2₁2₁2（以下、P-GI结晶）の空間群を持つ構造です。これまで、I-GI结晶は完全结晶に匹敵する極めて高い品質を持つ结晶であることが分かっています[2]。

本研究では、P-GI结晶のデジタルX線トポグラフィにおいて、I-GI结晶と同じく転位に代表される结晶欠陥が存在しないことが分かりました。一方、结晶の回転軸に沿ってX線回折^＊6位置が変化する特异なふるまいが観测されました（図2）。このふるまいは10^-6~10^-5 º/µm程のわずかな“ねじれ”に起因していることが分かりました。これは、本研究グループが最近報告した鶏卵白リゾチーム结晶の微小な“ねじれ”以下の大きさであることが分かりました。

さらに興味深いことに、结晶がねじれているにもかかわらず、I-GI结晶と同様に结晶の完全性を由来とするX線の動力学的回折^＊7現象が観測されました。具体的には、ロッキングカーブの振動現象です。この動力学的回折現象はダイヤモンドやSi结晶など、極めて完全性の高い限られた结晶でしか観察されていません。しかし、P-GI结晶で観測されたふるまいは、Ⅹ線の動力学的回折理論から予測されるふるまいからわずかにずれていることが分かりました（図3）。さらに、结晶のねじれが大きいほど、理論からのずれが大きくなることが分かりました。これはP-GI结晶の不完全性が“ねじれ”に起因していることを示しています。すなわち、“ねじれ”が结晶の不完全性として残された最後の欠陥であり、“ねじれ”の制御が结晶の品質制御に重要であることを示しています。

完全结晶であるI-GI结晶とねじれ结晶であるP-GI结晶の结晶構造データより、I-GI结晶のGI分子間の接触（相互作用）は等方的である一方、P-GI结晶では分子間接触が異方的であることが分かりました（図4）。结晶の“ねじれ”の原因について、これまでにいくつかメカニズムが提案されていますが、そのほとんどが温度や圧力などの外的な環境因子により説明されています。一方、これまで本研究グループが発見したタンパク质结晶の微小な“ねじれ”の起源は、结晶を構成するタンパク质分子の形状に由来することを提案してきました。本研究により、同一分子から完全结晶とねじれ结晶が観測されたことで、ねじれの起源として分子間接触の異方性を提案することができ、结晶のねじれの起源解明に一歩前進しました。また、结晶を構成する分子を由来とするより原理的で本質的な“ねじれ”のメカニズムとして注目される理論モデル「geometrical frustration（幾何学的フラストレーション）」を改善できる重要な実験的証拠となる可能性があります。

本研究では、同一のタンパク质を用いて、完全结晶とねじれ结晶の存在を明らかにしました。デジタルX線トポグラフィによるロッキングカーブイメージングの回折理論に基づいた解析から、微小な“ねじれ”が结晶に取り残された最後の结晶欠陥であることが分かりました。また、结晶構造情報から、その“ねじれ”の起源として、结晶を構成する分子間の異方的な接触（相互作用）であることが示唆され、“ねじれ”の原理解明に一歩前進しました。タンパク质をはじめとした分子性结晶の“ねじれ”の制御により、新薬開発のための単结晶構造解析のみならず、材料の開発促進が期待されます。

X線トポグラフィ測定はKEKのフォトンファクトリーBL-14B、BL-20B（Proposal Nos. 2019G103, 2021G022, 2023G030）にて行われました。本研究の一部は、科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業さきがけ（JPMJPR1995）、JSPS科研费（19K23579, 21K04654, 23H01305）の支援を受けて実施されました。

タイトル：Unraveling Polymorphism and Twisting in Near-Perfect Protein Crystals
著者：Ryo Suzuki, Marina Abe, Kenichi Kojima, Masaru Tachibana
掲載雑誌：The Journal of Physical Chemistry Letters
顿翱滨：

＊1 タンパク质结晶：タンパク质分子が規則正しく配列した结晶。タンパク质の结晶によるＸ線回折の強度を解析することにより、タンパク质分子の３次元構造を知ることができる。
＊2 放射光：電子を光とほぼ等しい速度まで加速させ、電磁石を用いて進行方向を曲げたときに発生する高指向性の強力な電磁波のこと。X線の波長域を含んでおり、実験では単色化したX線を使用している。
＊3 フォトンファクトリー（PF）：「光の工場」という意味の名で知られる、KEKのつくばキャンパスにある放射光施設。1982年に運転を開始し、X線領域では日本で最初の放射光専用加速器である。数度の改造を経て放射光の高輝度化を図ってきた。国内外の大学等から年間3000人を超える研究者に利用されている。
＊4 デジタルX線トポグラフィ：X線トポグラフィとは回折X線の強度の変化を用いて、结晶内の结晶欠陥を観察する非破壊の手法のこと。デジタルX線トポグラフィでは、従来のX線トポグラフィで使用するX線フィルムの代わりにX線のデジタル検出器を使用する。従来のX線トポグラフィでは困難な角度や時間の情報など、多角的なイメージングが可能となる。
＊5 ロッキングカーブ測定：X線回折が生じている结晶を連続的に回転するときに得られる回転角に依存した回折X線の強度を測定する方法。角度と回折強度の変化を追うことで、结晶の品質を定量的に評価することが出来る。
＊6 X線回折：試料にX線を照射し回折X線を検出して、対象物の構造を非破壊で解析する技術
＊7 動力学的回折：X線が结晶中で多重散乱を起こす回折。ダイヤモンドや半導体Siなどの完全性の高い结晶（完全结晶）でのみ観察される。

 [1]. Marina Abe, Ryo Suzuki, Keiichi Hirano, Haruhiko Koizumi, Kenichi Kojima, Masaru Tachibana, Existence of twisting in dislocation-free protein
         single crystals. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 119 (2022) e2120846119.
         タンパク质の结晶のほとんどはねじれている！ －微小な“ねじれ”の観測に成功－（横浜市立大学プレスリリース）
         /news/2022/20220518tachibana.html
[2]. Ryo Suzuki, Haruhiko Koizumi, Keiichi Hirano, Takashi Kumasaka, Kenichi Kojima, and Masaru Tachibana, Analysis of oscillatory rocking curve by
        dynamical diffraction in protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115 (2018) 3634.
        タンパク质结晶における動力学的回折現象の観察に成功～より高精度な構造解析法の確立に期待～（横浜市立大学プレスリリース）
         /news/2017/20180322Tachibana.html

横浜市立大学　広报担当
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